Intersticio ¿un nuevo órgano?

Petros C. Benias, Rebecca G. Wells, Bridget Sackey-Aboagye, Heather Klavan, Jason Reidy, Darren Buonocore, Markus Miranda, Susan Kornacki, Michael Wayne, David L. Carr-Locke y Neil D. Theise

Abstracto

La endomicroscopía con láser focal (pCLE) proporciona imágenes histológicas en tiempo real de tejidos humanos a una profundidad de 60-70 μm durante la endoscopia. El pCLE del conducto biliar extrahepático después de la inyección de fluoresceína demostró un patrón reticular dentro de los senos llenos de fluoresceína que no tenían un correlato anatómico conocido. La congelación del tejido de la biopsia antes de la fijación preserva la anatomía de esta estructura, demostrando que es parte de la submucosa y un espacio intersticial lleno de líquido previamente no apreciado, drenando a los ganglios linfáticos y soportado por una compleja red de gruesos haces de colágeno. Estos haces están revestidos intermitentemente de un lado por células similares a fibroblastos que se tiñen con marcadores endoteliales y vimentina, aunque existe una interfaz no alineada muy extensa e inusual entre las proteínas de la matriz de los haces y el fluido circundante. Observamos estructuras similares en numerosos tejidos que están sujetos a compresión intermitente o rítmica, incluidas las submucosas de todo el tracto gastrointestinal y la vejiga urinaria, la dermis, los tejidos blandos peri-bronquiales y periarteriales, y la fascia. Estas estructuras anatómicas pueden ser importantes en la metástasis del cáncer, el edema, la fibrosis y el funcionamiento mecánico de muchos o todos los tejidos y órganos. En resumen, describimos la anatomía y la histología de un espacio macroscópico, lleno de líquido y previamente desconocido, aunque ampliamente diseminado dentro y entre los tejidos, una novedosa expansión y especificación del concepto del intersticio humano.

Introducción

El espacio intersticial es la principal fuente de linfa y es un importante compartimiento de líquidos en el cuerpo. Si bien la anatomía y la composición del espacio intersticial entre las células se comprende cada vez más, la existencia, ubicación y estructura de los espacios inter e intragrandes de mayor tamaño se describen solo vagamente en la literatura. Esto es particularmente importante en referencia al “tercer espaciamiento” (acumulación de líquido intersticial) y al considerar el flujo y el volumen global de líquido intersticial, que no se han estudiado bien.

Los avances en microscopía in vivo ofrecen el potencial para identificar nuevas estructuras anatómicas funcionalmente relevantes en humanos. Los vasos linfáticos en el cerebro, por ejemplo, fueron identificados recientemente por primera vez utilizando imágenes de microscopía multifotónica in vivo a través de una preparación de cráneo adelgazada. La endomicroscopía con láser focal basada en sondeos (pCLE) es una tecnología de obtención de imágenes in vivo que proporciona una evaluación histológica en tiempo real de las estructuras tisulares durante la endoscopia, generalmente después de la inyección intravenosa de fluoresceína. Nosotros y otros hemos observado que, en los conductos biliares extrahepáticos y los conductos pancreáticos, pCLE a la distancia focal fija de 60-70 μm muestra un “patrón reticular” submucoso (Fig. 1A, B) que consiste en bandas de ramificación oscuras de 20 μm de ancho alrededor espacios poligonales grandes llenos de fluoresceína3. Estos no tienen una correlación obvia con las estructuras conocidas. Aunque los endoscopistas han sugerido que esta red representa capilares o linfangiolas3, ninguna estructura puede explicar el patrón reticular de las bandas oscuras y los espacios brillantes llenos de líquido.

Figura 1
De: Estructura y distribución de un intersticio no reconocido en tejidos humanos.

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Identificación del patrón reticular del conducto biliar y demostración del espacio submucoso. (A, B) pCLE del conducto biliar después de la inyección de fluoresceína muestra un patrón reticular a una profundidad de 60-70 μm. Barra de escala, 20 μm. (C-E) El tejido del conducto biliar retirado en el momento de la cirugía de Whipple se congeló y se realizó pCLE ex vivo, lo que demuestra la persistencia del patrón reticular. Barra de escala, 20 μm. (F) El tejido congelado no teñido de la submucosa de un conducto biliar fotografiado por microscopía fluorescente, que muestra el patrón reticular en esta capa de pared del conducto biliar. Los espacios “brillantes” ahora están oscuros (el fluido fluoresceinado se drenó durante el procesamiento y las estructuras tisulares permanecieron teñidas con fluoresceína residual). (G) El tricrómico de Masson del conducto biliar recién congelado muestra que las bandas oscuras son haces de colágeno (azul) (izquierda). La esquina superior derecha muestra el tricrómico de Masson de un conducto biliar normalmente procesado / fijo del mismo paciente, con colapso de los espacios y adherencia aparente de los haces de colágeno entre sí. La parte inferior derecha muestra la muestra fija teñida con H & E; los espacios delgados entre las capas de colágeno (flechas) reflejan espacios llenos de líquido que se colapsan casi por completo. (H) Los conductos biliares congelados (arriba) y fijos (abajo) inmunoteñidos con anticuerpos contra CD34 (izquierda, marrón) y D2-40 (derecha, marrón) muestran células que recubren los haces de colágeno; tenga en cuenta que los paquetes a menudo parecen tener una celda de revestimiento en un lado, pero no en el otro (20 ×, DAB, hematoxilina). (I) Esquema del espacio lleno de líquido sostenido por una red de haces de colágeno revestidos de un lado con células. Ilustración de Jill Gregory.

Presumimos que este patrón refleja una extensión del espacio intersticial intercelular. Llevamos a cabo un estudio en profundidad utilizando pCLE e histología de la vía biliar extrahepática humana con el fin de identificar los correlatos microanatómicos del patrón reticular. Presentamos aquí la existencia de un novedoso espacio intersticial (es decir, prelinfático) definido por un complejo entramado de haces de colágeno gruesos. Observamos estructuras similares cuando ampliamos nuestro estudio para incluir la dermis, el estroma peri-arterial, la submucosa de las vísceras (tracto gastrointestinal, vejiga urinaria), el árbol bronquial de los pulmones y los planos fasciales del sistema musculoesquelético y el tejido adiposo, y como un resultado propone una revisión a gran escala de la macro y microanatomía del intersticio humano.

Resultados

Las muestras se obtuvieron a partir de muestras quirúrgicas de los conductos biliares resecados durante doce cirugías pancreatico-biliares. Varios minutos antes de la ligadura vascular y la resección de la pieza quirúrgica, los pacientes fueron infundidos intravascularmente con fluoresceína con visualización directa in situ por pCLE del patrón reticular (Fig. 1A, B). El sitio fue resecado y luego escaneado de nuevo inmediatamente con pCLE ex vivo, confirmando que el patrón reticular y la fluoresceína seguían intactos después de la resección (datos no mostrados). A continuación, las muestras se incrustaron en medio de sección congelada, se congelaron rápidamente usando un aerosol de congelación a base de aerosol, y se volvieron a formar imágenes (Fig. 1C, D, E). Las secciones congeladas en serie se cortaron perpendicularmente al ángulo de visión del pCLE exactamente en la cara con respecto a la superficie del lumen, marcando secciones cada 5 μm hasta que se alcanzó una profundidad de 60-70 μm. También realizamos secciones seriales de tejido en un plano transversal. Estas secciones se visualizaron bajo microscopía de fluorescencia de rutina (Fig. 1F), que muestra que el patrón reticular se correlacionaba con haces gruesos, teñidos con fluoresceína (vistos en pCLE como bandas negras). La ausencia de fluorescencia entre estos haces en los portaobjetos finales se debe al proceso de preparación de portaobjetos en sección congelada (secado al aire, fijación y lavado) que hace que el fluido drene del portaobjetos final.

Las secciones congeladas en paralelo se tiñeron con tinción con tricrómico de Masson, lo que confirma la presencia de bandas de colágeno que separan los espacios abiertos, anteriormente llenos de líquido (Fig. 1G, izquierda). Estas estructuras co-localizadas con la submucosa biliar compacta normalmente observada en las muestras de biopsia y resección (Fig. 1G, derecha, del mismo paciente que la muestra a la izquierda). Esto sugiere que la estructura densa previamente descrita de la submucosa representa un artefacto debido a la pérdida de fluido durante la escisión y fijación del tejido, haciendo que los haces de colágeno normalmente separados colapsen y se adhieran entre sí. Observamos que el patrón reticular apareció dentro de los 30 segundos de la infusión intravascular de fluoresceína, aproximadamente en el mismo momento en el que se visualizan los ganglios linfáticos, pero más tarde que cuando se visualizan las estructuras vasculares4. Esto sugiere que es una forma de espacio intersticial en el que se acumula o forma fluido intersticial o “prelinfático”. La inmunotinción de la submucosa hepática fija y congelada mostró tinción positiva de CD34 y D2-40 en un lado de cada haz de colágeno (Fig. 1H). La inmunotinción fue negativa para otros marcadores endoteliales linfovasculares (CD31, ERG, LYVE-1), pero uniformemente positiva para el marcador mesenquimático vimentina (datos no mostrados). Las tinciones para el marcador mioepitelial de la actina del músculo liso, el marcador de células madre CD117 y la beta-catenina nuclear fueron negativas (datos no mostrados). La Figura 1I es un esquema que resume las observaciones histológicas.

Los estudios ultraestructurales (Fig. 2A, B) muestran que los haces de colágeno están revestidos asimétricamente en un lado por células finas y planas (en forma de huso en sección transversal) que tienen un citoplasma escaso y un núcleo oblongo. Estas células son similares a fibroblastos, sin estructuras específicas de tipo celular; en particular, están desprovistos de características ultraestructurales indicativas de diferenciación endotelial, que incluyen vesículas pinocitóticas y cuerpos de Weibel-Palade. La microscopía electrónica también muestra que estas células no tienen membrana basal, lo que sugiere que se adhieren directamente a los haces de colágeno subyacentes, y que, aunque un lado de un haz de colágeno determinado está revestido por estas células, el lado opuesto suele estar sin revestimiento y directamente expuesto a fluido en el espacio. Los haces se visualizan bien mediante imágenes de generación de segundos armónicos (figura 2C), confirmando que son colágeno fibrilar. También se observan fibras elásticas autofluorescentes, como lo confirma la apariencia similar de la lámina elástica en las arterias del mismo tejido (figura 2C, recuadro) y mediante una tinción histoquímica elástica de Van Gieson (figura 2D).

Figura 2

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Evaluación estructural del espacio intersticial. (A) El microscopio electrónico de transmisión muestra haces de colágeno (asteriscos) que están compuestos de fibrillas de colágeno bien organizadas. Algunos haces de colágeno tienen una única célula plana a lo largo de un lado (puntas de flecha). Barra de escala, 1 μm. (B) Mayor aumento muestra que las células (punta de flecha) carecen de características de endotelio u otros tipos de células y no tienen membrana basal. Barra de escala, 1 μm. (C) Las imágenes de generación de segundos armónicos muestran que los haces son de colágeno fibrilar (azul oscuro). Las fibras de color cian son de autofluorescencia y es probable que sean elastinas, como lo demuestra la autofluorescencia similar en la lámina elástica de una arteria cercana (recuadro) (40 ×). (D) La tinción elástica de Van Gieson muestra fibras de elastina (negras) que corren a lo largo de haces de colágeno (rosa) (40 ×).

Las características histológicas características de esta estructura de la submucosa del conducto biliar (espacios llenos de líquido y con haces de colágeno alineados asimétricamente por células planas) se visualizan fácilmente en otros tejidos. La estructura se reconoció consistentemente en la dermis en muestras de resección clínica de la piel (Fig. 3A), y pCLE se aplicó a regiones delgadas de la piel in vivo después de la inyección de fluoresceína mostró el mismo patrón reticular en la dermis que en el conducto biliar. Los espacios llenos de líquido y los haces de colágeno revestidos por células que se tiñen para CD34 se observan en histología en múltiples órganos y tejidos, incluso en la submucosa de todo el tracto digestivo, la vejiga urinaria, el tejido peribronquial, la fascia y el estroma de arterias y venas de todos tamaños (Fig. 3B y Supplemental Fig. 1).

Figura 3 whatsapp-image-2018-03-28-at-9-59-08-am.jpeg

Se encuentra un espacio intersticial en la dermis y la submucosa y otros tejidos fibroconectores en todo el cuerpo. (A) La piel teñida con H & E (superior izquierda 10 ×, superior derecha 40 ×) muestra las mismas estructuras identificadas en el conducto biliar extrahepático. Inmunostain para CD34 (abajo a la izquierda, marrón DAB, azul claro counterstain de hematoxilina, 40 ×) destaca que las células del revestimiento son intermitentes y, a menudo en un lado de los haces de colágeno, pero no en el otro. El pCLE aplicado a la piel in vivo después de esta observación histológica confirma que el aspecto histológico predice el patrón reticular in vivo cuando se aplica pCLE a la piel. (B) Esquema que muestra la ubicación de las estructuras histológicas idénticas observadas en los tejidos fibroconectores en todo el cuerpo (ver la Fig. 1 complementaria para las imágenes de histología). Ilustración de Jill Gregory.

Estas estructuras parecen ser espacios prelinfáticos, como se sugiere al examinar especímenes de resección de cáncer colorrectal con tatuajes submucosos (figura 4A) en los que el pigmento negro está presente en macrófagos dentro del espacio intersticial (figura 4B) y en macrófagos asociados , drenando los nódulos linfáticos mesentéricos (Fig. 4C). Estos macrófagos no se ven en los espacios intersticiales en el examen de los tejidos normales y se presume que ingresan al intersticio en respuesta a la presencia de material extraño. Además, el examen de muestras de resección de intestino delgado de hernias encarceladas con intestino proximal obstruido muestra una submucosa con proyección difusa de los haces de colágeno por fluido proteináceo (rosa) (Fig. 2 complementaria) histológicamente similar a la linfa.

Figura 4

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Continuidad entre intersticio y drenaje linfático. (A-C) tejido de colon con tatuaje submucoso. (A) Pigmento negro inyectado endoscópicamente en la submucosa de la pared del colon antes de la resección de la neoplasia maligna del colon (H & E, 10 ×). (B) El pigmento negro está presente en los macrófagos en los espacios entre los haces de colágeno (H & E, 40 ×). (C) Los macrófagos que contienen pigmentos están presentes en los ganglios linfáticos mesentéricos que drenan el colon tatuado, lo que demuestra que el espacio intersticial se comunica funcionalmente con el drenaje linfático del colon (H & E, 20 ×). Imágenes típicas de 4 muestras independientes evaluadas. (D-F) Carcinoma gástrico en estadio T2, pobremente diferenciado. (D) El carcinoma gástrico presente en la superficie de la mucosa (flechas) invade la submucosa (cabezas de flecha); la invasión más profunda y la invasión linfovascular no se observaron (H y E, 4 ×). (E) Las células tumorales mal diferenciadas se infiltran, individualmente y en grupos muy pequeños, a través del espacio intersticial de la submucosa gástrica, aislando los haces de colágeno preexistentes (H & E, 40 ×). (F) Carcinoma metastásico en el drenaje de los ganglios linfáticos mesentéricos de la muestra de resección gástrica; ninguna otra metástasis se identificó clínica o histológicamente (H & E, 20 ×). (G-I) Etapa T2 melanoma maligno de la piel del brazo izquierdo. (G) melanoma maligno (azul oscuro) que invade la dermis; invasión linfovascular no identificada (H & E, 4 ×). (H) Las células de melanoma maligno se infiltran, por separado y en grupos muy pequeños, a través del espacio intersticial de la dermis, aislando los haces de colágeno preexistentes (H & E, 40 ×). (I) Melanoma maligno metastásico en el drenaje de los ganglios linfáticos axilares; no se identificaron otras metástasis clínica o histológicamente (H & E, 10 ×).

La naturaleza prelinfática del espacio se enfatiza adicionalmente mediante el estudio de tumores tumorales invasivos en estadio T2 (Fig. 4D-F, n = 3) y piel (Fig. 4G-I, n = 2). La invasión en estadio T2 del estómago se define como la invasión a la submucosa, pero no más profunda. La invasión de T2 en la piel, asimismo, indica una invasión directamente en la dermis, pero no más profunda. La invasión por un carcinoma gástrico invasivo poco diferenciado (Fig. 4D) muestra diseminación a través del espacio intersticial, rodeando haces de colágeno todavía intactos (Fig. 4E); a pesar de que no hay invasión linfovascular demostrable en esta muestra, hay metástasis en un ganglio linfático mesentérico que drena (Figura 4F). En un melanoma maligno que se origina en la parte superior del brazo e invade directamente en la dermis (Fig. 4G), existe una diseminación similar a través del espacio intersticial con el aislamiento de los haces de colágeno (Fig. 4H); nuevamente, a pesar de la ausencia de invasión linfovascular demostrable, hay metástasis en un ganglio linfático axilar que drena (Figura 4I). En ambos casos, no se identificaron otras lesiones o vías de diseminación incluso después del examen clínico e histológico completo de los pacientes.

Discusión

Proponemos aquí una revisión de los conceptos anatómicos de la submucosa, la dermis, la fascia y la adventicia vascular, lo que sugiere que, en lugar de ser paredes densamente compactas de colágeno, son espacios intersticiales llenos de líquido. La presencia de líquido tiene implicaciones importantes para la función y la patología del tejido. Nuestros datos que comparan tejidos rápidamente biopsiados y congelados con tejidos fijados de manera estándar sugieren que los espacios que describimos, soportados y organizados por un enrejado de colágeno, son compresibles y distensibles y pueden servir así como amortiguadores. Todos los órganos en los que hemos detectado esta estructura están sujetos a ciclos de compresión y distensión, ya sean relativamente constantes (pulmones, aorta) o intermitentes (tracto digestivo después de una comida, vejiga urinaria durante la micción, piel bajo compresión mecánica, planos fasciales durante acción del sistema musculoesquelético). El intersticio dérmico y el intersticio fascial pueden ser mecánicamente importantes para explicar el edema (como en el caso del intestino pre-obstruido en la Fig. 2 complementaria). El “tercer espaciamiento” en el linfedema postoperatorio (como cuando se extirpan los nódulos de drenaje) y el anasarca debido a insuficiencia hepática, renal o cardíaca pueden reflejar distensión de líquido y estasis en este espacio intersticial. El espacio intersticial submucoso del árbol biliar, que se extiende a lo largo de toda la extensión del estroma portal extra e intrahepático, puede explicar el edema del conducto característico que se desarrolla rápidamente en la obstrucción aguda del conducto biliar grande.

Un apoyo adicional para la relación entre la histología que observamos y la estructura in vivo proviene de la ecografía de los tejidos. La ecografía endoscópica del conducto biliar muestra que consta de tres capas, la mitad de la cual comprende el 90% del espesor de la pared y está llena de líquido; corresponde al intersticio submucoso. Los espacios submucosos de otras vísceras, la dermis y la fascia parecen heterogéneos por ultrasonido, típicamente indicativos de líquido o tejido adiposo, mientras que el estroma colagenizado verdaderamente denso, como en tendones y ligamentos, aparece oscuro por ultrasonido. Apoyo adicional para nuestras observaciones se encuentra en estudios ultraestructurales publicados de piel, apéndice vermiforme y adventicia peria-aórtica, que también parecen haber incluido estas estructuras, aunque no estaban bien caracterizadas. En el hígado, el “espacio de Mall” previamente identificado en la región portal puede representar este interstitium15. De hecho, los dibujos originales de Mall, derivados de los estudios de inyección, parecen representar las mismas estructuras que identificamos aquí16.

La naturaleza de las células del revestimiento no está clara. Mientras que las células del conducto biliar extrahepático se tiñeron tanto para CD34 como para D2-40, la tinción de D2-40 estuvo ausente en todos los demás tejidos examinados. Las células endoteliales vasculares también expresan conjuntamente CD34 y vimentina, pero la falta de características endoteliales en el microscopio electrónico excluye esta clasificación para las células del revestimiento intersticial que observamos, sugiriendo en cambio que son una nueva forma de fibroblasto CD34-positivo o incluso células madre mesenquimales17. . No se sabe si son las células que depositan los haces de colágeno; si es así, serían importantes en la formación de cicatrices en la cicatrización de heridas. En particular, las cicatrices queloides muestran haces de colágeno y grandes espacios que parecen ser una exageración de estas estructuras en la dermis subyacente18. Los datos recientes que muestran que las cicatrices queloides aparecen en las regiones de la piel sometidas a alta tensión plantean interrogantes sobre el impacto de las fuerzas mecánicas y el flujo de fluidos sobre las estructuras y las células de este espacio19.

Es probable que el intersticio submucoso que describimos corresponda a los espacios intersticiales descritos en estudios de clusters celulares metastatizantes20. La presencia de una red de canales submucosos en los tractos digestivo y urinario podría explicar la gran probabilidad de metástasis de los tumores luminales invasivos una vez que alcanzan la submucosa. Como lo ilustran los casos que mostramos de melanoma invasivo y cáncer gástrico (Figura 4D-I), la presencia de canales llenos de líquido submucoso / dérmico también sugiere la razón por la cual las lesiones T2 tienen un riesgo significativamente mayor de metástasis sobre lesiones en estadio T1 Debido a que las submucosas viscerales y la dermis son espacios abiertos y llenos de líquido, en lugar de una pared densa de tejido conjuntivo, pueden ser fácilmente transitados por células tumorales invasivas. Además, la presión mecánica en tales espacios (peristalsis en el tracto digestivo, compresión y / o presión asociada al movimiento en la piel) podría promover aún más la diseminación a través de estos espacios. Si las células del revestimiento intersticial son los precursores de los miofibroblastos fibrogénicos, también podrían funcionar como primeros respondedores en la esclerosis peri-tumoral del árbol pancreatico-biliar, el tubo digestivo tubular, el árbol bronquial, la vejiga urinaria y la piel. De hecho, se ha informado una población única de CD34 / vimentina que coexpresa fibroblastos peritumorales. Estas células también podrían desempeñar papeles importantes en condiciones escleróticas no malignas incluida la atresia biliar y la colangitis esclerosante primaria en el árbol biliar, la esclerodermia en la dermis y el esófago y la enfermedad inflamatoria intestinal en el tracto digestivo. Los estudios en curso se centran en la caracterización de estas células y sus funciones. El flujo de líquido intersticial a través del espacio submucoso del tracto gastrointestinal luminal probablemente esté guiado por el peristaltismo, en paralelo con los contenidos luminales. Si hay comunicación entre la luz intestinal y el espacio submucoso, esto plantea la posibilidad de que la señalización celular (incluidas las señales hormonales o inmunológicas) pueda regularse de una manera proximal a distal determinada por la velocidad del peristaltismo. Las interacciones inmunológicas en este espacio intersticial también podrían ser importantes en afecciones inflamatorias como la colangitis esclerosante primaria, la pancreatitis crónica, la enfermedad inflamatoria intestinal y la esclerodermia. Curiosamente, si bien los macrófagos no se observaron en estos espacios en los tejidos normales examinados, trafican claramente en el espacio para tomar el pigmento del tatuaje después de la inyección submucosa (Fig. 4A-C). Los haces de colágeno en el espacio intersticial están alineados solo un lado por las células, lo que implica que la matriz de colágeno en el lado opuesto está en contacto directo con el fluido intersticial. Hay pocos ejemplos conocidos en el cuerpo humano además del espacio intersticial entre las células, el glomérulo renal y el espacio de Disse, donde el fluido está en contacto directo con las proteínas de la matriz sin una barrera celular intermedia. Las fibras de colágeno, que son moléculas cargadas, pueden formar una superficie fisiológicamente activa importante. Si las células del sistema inmune u otras células que atraviesan el espacio interactúan con los haces de colágeno es una cuestión altamente fisiológicamente relevante que requiere mayor investigación. En resumen, mientras las descripciones típicas del intersticio sugieren espacios entre las células, describimos espacios macroscópicamente visibles dentro de los tejidos – senos dinámicamente comprimibles y distensibles a través de los cuales fluye el líquido intersticial alrededor del cuerpo. Nuestros hallazgos requieren la reconsideración de muchas de las actividades funcionales normales de diferentes órganos y de la dinámica de fluidos desordenada en el contexto de la enfermedad, incluida la fibrosis y la metástasis. Una submucosa sometida a flujo peristáltico direccional no es la pared de tejido conjuntivo denso previamente prevista, sino un conducto potencial para el movimiento de agentes perjudiciales, moléculas de señalización pro-fibrogénicas y células tumorales. Esto plantea la posibilidad de que el muestreo directo del fluido intersticial pueda ser una herramienta de diagnóstico. Finalmente, nuestro estudio demuestra el poder de la microscopía in vivo para generar nuevos conocimientos sobre la anatomía y la fisiología de los tejidos normales y enfermos.

Métodos

Pacientes y muestras de tejido

Trece pacientes sometidos a resección quirúrgica del árbol biliar en Mount Sinai Beth Israel fueron reclutados para participar en este estudio entre julio de 2012 y diciembre de 2013. El estudio se realizó con la aprobación de y de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la Escuela Icahn de Medicina en Mount Sinai (Mount Sinai Beth Israel Medical Center) Institutional Review Board (IRB). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes para participar en el estudio (incluida la inyección intraoperatoria con fluoresceína y pCLE) y el examen de la muestra resecada bajo microscopio para evaluar los márgenes quirúrgicos con endomicroscopía confocal con láser basada en sonda (pCLE). Los criterios de inclusión incluyen la capacidad de dar consentimiento informado y la edad superior a 18 años. Se obtuvieron tejidos adicionales para el estudio de otros órganos a partir de materiales de archivo fijos, exentos de la revisión del IRB.

Evaluación intraoperatoria y perioperatoria

Los pacientes fueron infundidos con 2.5 ml de fluoresceína al 10% justo antes de la ligadura vascular y la extracción de la muestra (que tomó aproximadamente 5-10 minutos en todos los casos). Posteriormente se estudiaron más las muestras de conductos biliares periféricos, del conducto pancreático y de la pared duodenal de las muestras de resección final.

Se obtuvieron muestras de pacientes a los que se les inyectó fluoresceína (conducto biliar común = 10, conducto pancreático = 3, duodeno = 3, ganglio linfático = 1) y pacientes control no inyectados (conducto biliar común = 3, conducto pancreático = 1, duodeno = 1, nódulo linfático = 1). Algunas muestras quirúrgicas fueron lo suficientemente grandes como para permitirnos estudiar varios tejidos diferentes.

Procesamiento y evaluación de muestras

Las muestras se escanearon con pCLE (Mauna Kea Technologies, Cellvizio® Cholangioflex miniprobe) ex vivo inmediatamente después de la eliminación, confirmando que el patrón reticular y la fluoresceína estaban intactos. Las muestras se incrustaron luego en medio de congelación de OCT a base de glicerina y se congelaron rápidamente usando un aerosol de congelación a base de aerosol (Cyto-Freeze de Thomas®) para asegurar la retención de fluoresceína y la formación mínima de cristales de agua. Las muestras estaban incrustadas con el lado luminal hacia arriba o en sección transversal. Algunos especímenes eran lo suficientemente grandes como para ser bisecados y evaluados en ambos planos. Todas las muestras se almacenaron a -20 ° C. Comenzando en la superficie luminal de los conductos biliares en cara y los conductos pancreáticos, las secciones congeladas se cortaron consecutivamente con un espesor de 5 μm a una profundidad de 60-70 μm. También realizamos secciones seriales de tejido en un plano transversal al conducto biliar.

Las muestras se montaron en portaobjetos de vidrio sin fijador y secadas al aire, después de lo cual se trataron usando un protocolo de sección congelada a base de xileno, se cubren con cubreobjetos y se evaluaron y fotografiaron usando un microscopio fluorescente con un filtro de excitación FITC (475-490 nanómetros).

Tinción inmunohistoquímica

La inmunotinción se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar22. Las muestras fijas se desparafinaron primero. Las muestras de secciones congeladas se secaron al aire y se fijaron al calor. Después de una noche de incubación a 4ºC con anticuerpo primario (Tabla 1 complementaria) y lavado con PBS, se sometieron secciones de 4 μm a anticuerpo secundario biotinilado y a continuación a reactivo enzimático biotinilado con avidina (peroxidasa de rábano picante biotinilada con avidina). Después de la incubación con 1-3 gotas de sustrato de peroxidasa (DAB-3,30-diaminobenzidina; 0,6 mg / ml de H2O20,03% en tampón Tris-HCl 0,01 M, pH 7,6) y posterior lavado en H2O desionizada, las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Gill y montado bajo montura de cristal a base de xileno.

Microscopio de electrones

Las muestras para microscopía electrónica se fijaron en fijador Karnovsky, se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio tamponado con fosfato al 1% y se incrustaron de manera estándar. Se cortaron secciones epoxi ~ 80 nm en un AO / Reichert Ultracut, se tiñeron con uranilo y sales de plomo, y se examinaron en un microscopio electrónico Zeiss EM 900 a 80 kV.

Segundo análisis de generación armónica

La microscopía de generación de segundo armónico de colágeno (SHG) se realizó en portaobjetos no teñidos usando un microscopio confocal / multifotón Leica TCS-SP5 con un láser Coherent Chameleon Ultra II sintonizado a una longitud de onda de 900 nm. Las imágenes se adquirieron con detectores no desangrados.

Disponibilidad de datos

No se generaron o analizaron conjuntos de datos durante el estudio actual.

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